Klostridie jsou trochu jako kočky, dělají si, co chtějí a kdy chtějí

Bylo pro Vás získání grantu velkým překvapením?

Ano, opravdu velkým! Podílela jsem se na psaní celé řady úspěšných, ale i mnoha neúspěšných grantových přihlášek. Vlastní projekty, které jsem psala, byly zatím jen dva. První jsem na GA ČR podávala loni, byl hodnocený dobře, ale kvůli nedostatku financí nebyl podpořen, a druhý projekt GA ČR, ve kterém jsem se snažila reflektovat všechny připomínky oponentů, se mi již podařilo získat. Bylo pro mě velkým a příjemným překvapením, že jsem v této velmi konkurenční soutěži uspěla. Se studiem klostridií ale samozřejmě nezačínám od nuly, navazuji na dřívější projekt GA ČR profesorky Petry Patákové, ve kterém jsme se zaměřili na podíl bakteriálních efluxních pump na transportu jedné z chemikálií, kterou klostridie produkují, ven z buňky. Mimochodem, projekt získal výborné hodnocení a byl i navržen na cenu předsedy GA ČR. Možná i to přispělo k získání tohoto projektu.

Měly pro Vás přínos i letošní posudky?

Každý nezávislý pohled je přínosný, ale oponentní hodnocení vědecké části byla vesměs pozitivní, přičemž určitě pozitivněji vyzněla ta od zahraničních hodnotitelů. Panelisté hodnotí i vás jakožto navrhovatele a na slova chvály jsou poměrně skoupí. Přece jen kvalita vědců, kteří o granty žádají, je špičková a není snadné se mezi ně zařadit.

Čeho se projekt týká?

Projekt si klade za cíl porozumět vlivu inhibitorů pocházejících ze zpracování bioodpadu, konkrétně lignocelulózy, na fyziologii tzv. solventogenních klostridií. Solventogenní klostridie jsou mikroorganismy schopné produkovat celou řadu chemikálií, zejména rozpouštědel butanolu a acetonu (odtud název solventogenní), které v současné době vyrábí petrochemický průmysl. Klostridie tak nabízí biologickou cestu, která je plně v souladu se Zelenou dohodou pro Evropu (Green Deal). Pro tu je klíčová ještě druhá stránka, kdy nemůžeme a ani nechceme zpracovávat čisté látky, suroviny využitelné k lidské výživě nebo plodiny speciálně pro tyto účely pěstované, ale naopak se snažíme zpracovávat odpady. A naším odpadem, tedy vstupní surovinou výroby rozpouštědel, je lignocelulózová biomasa, nejhojnější obnovitelný materiál na Zemi. Mnohde sice není odpadem v pravém slova smyslu, ale jsou lokality, kde je jí takový přebytek, že za odpad může být považována. Lignocelulóza je přirozenou součástí buněčných stěn rostlin, je bohatým zdrojem sacharidů, sestává ze 3 hlavních složek, celulózy, hemicelulózy a ligninu. Její funkce je nejenom strukturní, ale i protektivní, což znamená, že příroda ji udělala natolik rigidní, aby se snadno rozložit nedala. Na její rozklad musíme použít buď chemikálie, drastičtější fyzikální podmínky nebo i mikroorganismy, ale v tom případě jsou procesy velmi pomalé, a tudíž průmyslově obtížně realizovatelné. Uvažovatelná cesta je tedy ta fyzikálně-chemická, jenomže při ní zase vznikají látky, které mají na mikroorganismy inhibiční vliv. Narážíme tedy na řadu problémů. Se spoustou inhibičních látek si ale klostridie umí do určité míry a za určitých podmínek poradit. A to je jádro našeho projektu, pochopit vliv inhibitorů ze zpracování lignocelulózy na fyziologii solventogenních klostridií a zjistit, jakým způsobem se s negativním působením vyrovnávají, a díky tomu najít cestu, jak přímo zpracovávat, pro mikroorganismy jinak toxické, hydrolyzáty lignocelulózy.

Proces produkce rozpouštědel s využitím klostridií je ale starý, že?

Ano, tento proces nedávno oslavil 100 let od první průmyslové produkce, která byla zahájena v roce 1916 ve Velké Británii a následovaly další velké provozy po celém světě, ale s růstem ceny surovin a rozvojem levnější výroby petrochemickou cestou zájem o biotechnologickou výrobu rozpouštědel opadl. A obnovuje se až nyní, díky možnosti využití obnovitelných zdrojů, a s tím se probudila i výzkumná aktivita. Ale i přes všechny pokroky a znalosti, které dnes máme, nástroje, které nabízí molekulární biologie, genetika, možnosti transformace mikroorganismů změnou jejich genetické informace, tak se dosud nepodařilo rozluštit klíčové události v životním cyklu klostridií a získat kmen, který by produkoval výrazně více rozpouštědel než přírodní izoláty. Neví se, co přesně spouští produkci rozpouštědel a také sporulaci, která je s tímto procesem spojována.

Jaký je životní cyklus klostridií?

Po vyklíčení spor se tvoří vegetativní pohyblivé tyčinky, které se rychle množí a tvoří hlavně kyseliny, máselnou a octovou (tzv. acidogeneze), tím ale dochází k rychlému okyselování kultivačního média a prudkému poklesu pH. Pro mikroorganismy se tak prostředí stává již příliš nehostinné a spouští novou část centrální metabolické dráhy, která umožňuje produkci rozpouštědel z původního substrátu, ale i částečnou přeměnu již vytvořených kyselin a tím pH okolního média opět mírně stoupá. Nově tvořená rozpouštědla působí na buňky toxicky a s jejich stoupající koncentrací postupně všechny vegetativní buňky odumírají. Někde v přechodném období z acidogeneze do solventogeneze se rozhoduje o tom, zda kultura bude sporulovat, či nikoli. Nezřídka se také stává, že k přepnutí do solventogeneze nedojde a kultura stejně tak odumírá, tentokráte ale vlivem nízkého pH a beze spor. Ty představují vysoce rezistentní formu schopnou přečkat velmi nepříznivé podmínky.

Jakto že dříve proces tak dobře fungoval?

I během velkoobjemové průmyslové produkce se někdy proces nepovedl, klostridie nepřešly z první fáze acidogeneze do fáze druhé, solventogeneze, a celá várka musela být zlikvidována, přičemž pro tyto nepovedené fermentace se vžil příhodný název „acid-crash“. Další fenomén, který na své objasnění teprve čeká. I nás by zajímalo, proč se to někdy nepovede. Je fascinující studovat a nacházet souvislosti a určitě se nebude jednat o jeden faktor, ale bude to kombinace několika věcí, mezi nimiž pravděpodobně důležitou roli hraje redoxní potenciál a přítomnost zbytkového kyslíku, který je pro klostridie toxický. To je dalším specifikem klostridií, jedná se o striktně anaerobní mikroorganismy a všechny procesy musí probíhat v prostředí bez přístupu vzduchu.

Abych se ale vrátila k otázce na dřívější produkci rozpouštědel. Proces, pokud běží dobře, je poměrně robustní a nenáročný na vybavení. V první polovině 20. století představovala biotechnologická produkce butanolu i acetonu nejjednodušší a nejlevnější cestu jejich výroby. Dnes je tento proces ekonomicky nerentabilní právě kvůli konkurenční chemické syntéze. Také dříve využívané levné substráty jako melasa, škrob nebo cukrová třtina jsou dnes příliš drahými a cennými surovinami. Nezbývá tedy než najít cestu výroby rozpouštědel z odpadů. (smích)

O jakých objemech se bavíme v případě Vašeho výzkumu?

Z hlediska výzkumu pro GA ČR a studia fyziologie buněk se bavíme hlavně o malých objemech, mikrolitrech až desítkách mililitrů. Zaměřujeme se na přepis genů v závislosti na přítomnosti inhibitorů, chceme sledovat, jakým způsobem buňka hospodaří s ATP, reguluje poměr NAD/NADH, jakým způsobem se adaptuje na přítomnost inhibitorů, jestli je umí transformovat a zda tato transformace klostridii přináší výhody a nevýhody, jak je ovlivněn celkový tok látek centrálním metabolismem, zda se na adaptačním procesu nějak podílejí transmembránové pumpy i jak se mění celkové fenotypové projevy a heterogenita populace, k tomu využíváme průtokovou cytometrii. Na toto všechno nám stačí velmi malé objemy. Na druhou stranu, v těchto objemech neumíme dost dobře řídit klostridiím prostředí, což umíme naopak v bioreaktorech, kde můžeme upravovat atmosféru, frekvenci míchání, dávkování živin, úpravu pH a mnoho dalších. Zároveň práce v bioreaktorech umožňuje online sledování řady důležitých parametrů a i z toho důvodu klíčové experimenty probíhají převážně zde. Nejčastěji pracujeme v objemech kolem jednoho litru v několika paralelních reaktorech současně.

Jak velký rozdíl je mezi chováním klostridií v mikroměřítku a v bioreaktoru?

S klostridiemi je spojen zásadní problém, a to, že si dělají, co chtějí a kdy chtějí. Jsou nevyzpytatelné a svéhlavé trochu jako kočky, když už si myslíte, že víte, jak na ně, změní taktiku. Vždy vás překvapí a chovají se jinak. Jiné je jejich chování ve stejném prostředí v mikrotitrační destičce, v Erlenmeyerově baňce i v bioreaktoru. Dosáhnout opakovatelnosti je nesmírně těžké. Jsou v tomto ohledu velmi specifickým mikroorganismem. Evidentně nečetly učebnice z mikrobiologie. Nevědí, že by měly následovat určitá pravidla.

Svůj podíl na obtížné převoditelnosti mezi jednotlivými měřítky má určitě i to, že klostridie mají rády blízkost a život v komunitě. Jinak se chovají, když rostou na pevném substrátu či v roztoku nebo je mícháme a jak moc. Proto se chceme zaměřit i na quorum sensing (komunikace buněk pomocí malých signálních molekul) a jeho vliv na spuštění solventogeneze či sporulace. Tam je ale ještě mnoho neznámých.

Za více než sto let s klostridiemi pracovaly stovky týmů. V čem je Vaše práce tak jiná, že jste získali grant v základním výzkumu?

Naše specifikum, v čemž jsme celosvětově unikátní, je zavedení cytometrické analýzy pro studium jednotlivých morfologických a fyziologických stádií klostridií. Během několika minut umíme charakterizovat populaci a definovat počet vegetativních buněk, kolik z nich je životaschopných, kolik zatím jen stresovaných a kolik už mrtvých. Vedle toho i počet buněk sporulujících, množství již uvolněných spor, případně stanovit, jestli část spor opětovně začne klíčit, či ne. Využíváme postup, kdy sledujeme specifický rozptyl světla dopadajícího laserového paprsku ovlivněný morfologií buňky a jejím složením a zároveň měříme enzymovou aktivitu uvnitř buňky a permeabilitu cytoplasmatické membrány pomocí specifických fluorescenčních sond. Metodiky běžně využívané ke stanovení životaschopnosti zavedené pro jiné mikroorganismy u klostridií nefungují a sporulaci s využitím cytometriie studuje jen málokdo. Hlavní limitace průtokové cytometrie v analýze bakterií spočívají v tom, že jsou, oproti mnohem častěji studovaným živočišným buňkám, strašně heterogenní. Chovají se variabilně i v rámci jediného kmene. Ten, který nejvíce studujeme my, Clostridium beijerinckii NRRL B-598, může třeba jen z hlediska morfologie vytvářet celou řadu tvarů, můžeme pozorovat vše od krátkých tlustých tyčinek až po dlouhá tenká vlákna, k tomu spory a všechna přidružená sporulační stadia. Proto se jen těžko dá nastavit jeden univerzální protokol a vždy musí přijít člověk, s určitou dávkou znalostí, aby výstupy z cytometru správně vyhodnotil.

Není tedy nějaký jednodušší způsob?

Samozřejmě můžeme využít tradiční kultivační přístupy nebo se podívat do mikroskopu, ale v něm vidíme pár buněk. V cytometru analyzujeme tisíce buněk za minutu a získáváme statisticky významné informace. Jsme schopni si populaci buněk rozdělit a podívat se na ně zvlášť, vidíme dynamiku procesu a můžeme ji porovnat s dynamikou systému za jiných podmínek. Sbíráme informace o populaci ze všech možných aspektů, cytometrická data kombinujeme s informacemi o přepisu genů, analýzou kapalných i plynných metabolitů, které se tvoří, online daty z bioreaktoru… A z toho se budeme snažit sestavit hypotézy, jak na klostridie inhibitory působí, co jim vadí, jaká je jejich reakce a jak se s nimi vyrovnávají.

Jak velký tým bude na projektu pracovat?

Jedná se o projekt plánovaný čistě v rámci VŠCHT, který ale zaměstná celý náš relativně malý tým. Pracovat na něm budu já s profesorkou Patákovou, dva stávající doktorandi a byla bych ráda, kdyby se mi přihlásil nový doktorand. A pak samozřejmě naši studenti, počítám s přidruženými tématy pro bakaláře i diplomanty. Dále počítám i s týmy, se kterými spolupracujeme doteď, zejména s bioinformatiky z Vysokého učení technického v Brně, s nimiž jsme měli předchozí grant GA ČR a kteří s námi na cestě za poznáním solventogenních klostridií urazili pořádný kus cesty.

Jaké jsou předpoklady pro doktoranda ve Vašem týmu?

Musí se naučit mít klostridie rád. (smích) Nadšení pro práci je klíčové, protože mnoho našich pokusů nekončí dle původních očekávání. Není to jako pracovat s mikroorganismy v laboratořích etablovanými, jako je Saccharomyces cerevisiae nebo Escherichia coli, které se chovají podle pravidel, a když si naplánujete pokus, tak většinou vyjde. U klostridií se poměr úspěšných k neúspěšným pokusům pohybuje povážlivě nízko a studenti bývají často frustrovaní, i když neočekávaný výsledek není jejich chybou, ale je specifickým rysem mikroorganismu. Na druhou stranu, a to jsem zapomněla zmínit, přinášejí klostridia řadu výhod. Tou hlavní, proč je chceme využít ke zpracování bioodpadů je velká metabolická variabilita a velmi široký utilizační potenciál. Jinými slovy, umí zpracovat a přeměnit řadu různých substrátů, v našem případě je pak významná schopnost využívat nejen glukózu ale i další hexózy a hlavně pentózy. Ty jsou v lignocelulóze hojně zastoupeny a klostridie tak biomasu efektivně využijí.

O jak dlouhé experimenty se jedná?

Standardní doba vsádkové kultivace je přibližně 3–4 dny, ale nejzajímavější fáze, růst a překlopení z acidogeneze do solventogeneze nastává v průběhu prvních 24 hodin. Jedná se o dynamický proces, po krátké lag fázi začíná prudce klesat pH, buňky se rychle množí, tvoří se hodně plynu (CO2 a H2), pak se pokles pH krátce zpomalí a dojde k přepnutí metabolismu do solventogeneze, pH začne stoupat, růst se zpomaluje a často následuje sporulace buněk. To vše se odehraje během prvního dne, další dny pak postupně narůstá koncentrace kýžených rozpouštědel až do spotřeby substrátu nebo častěji do dosažení limitní koncentrace rozpouštědel a kultura odumírá. Jsou i snahy o kontinualizaci procesu, ale kvůli dvoufázovosti metabolismu toho nelze dosáhnout v jednoduchém systému jednoho bioreaktoru. Proces musí být rozdělen do více bioreaktorů za sebou, z nich každý obsahuje kulturu v jiné fázi. I zde ale dochází k oscilacím místo ustáleného stavu, který je typický pro kontinuální produkce. Navíc, k udržení produkce rozpouštědel musí klostridie občas projít sporulačním cyklem, jinak mohou schopnost produkovat rozpouštědla dočasně nebo úplně ztratit.

Na stole vidím Vaši habilitační práci, která vyžaduje i zapojení ve výuce. Jaké předměty učíte?

Já se cítím dobře v laboratoři, v plášti, při zkoumání, ale pedagogiku beru za velmi důležitou součást mé práce na VŠCHT. Učím předmět Biologie II, který se zaměřuje hlavně na obecnou biologii buňky, a to pro studenty prvního ročníku bakalářského studia oborů Biochemie a biotechnologie a Bioinformatika a chemická informatika. Dále učím základy vinařství v rámci předmětů Biotechnologie II a Food Technology and Biotechnology.

Přednášíte hlavně o eukaryotní buňce, přičemž ale svůj výzkum zaměřujete na prokaryoty.

Je to rozdíl, ale baví mě i složitější eukaryotní systémy a já učím opravdu jen základy. I když se procesy v obou systémech v mnoha aspektech liší, fungování buněk je úžasně sofistikované a má obrovskou logiku. Doufám, že se mi to daří ukázat i studentům. V prvním ročníku je obrovská heterogenita posluchačů, učím studenty, kteří už téměř vše znají, a zároveň takové, kteří mají ze střední školy jiný základ, a to, co říkám, je pro ně jen obtížně pochopitelné. Byla bych ráda za intenzivnější komunikaci z jejich strany. Výuka v prvním ročníku je vesměs neosobní a zpětnou vazbu mám pouze, pokud někdo odpoví do ankety, těch reakcí ale bývá velmi málo. Jinak čerpám inspiraci pro pedagogickou práci i od svých dětí, jsou velmi kritickými hodnotiteli. Největší přínos ale mají určitě pro mé studenty, protože mám díky nim jednoznačně větší pochopení pro drobné přešlapy.

V případě výuky laboratorních cvičení a vedení bakalářských či magisterských prací je pro mě důležité, aby si studenti odnesli znalost metodik, pochopení věcí, naučili se prezentovat své výsledky, zvládli se vyrovnat s novým tématem a poprat se s výzvami, které budou potkávat.