Nobelova cena za chemii pro rok 2018

Enzymy jsou úžasné pro svou schopnost velmi specificky urychlovat chemické reakce. Velmi často se ale stává, že enzym nemá přesně ty vlastnosti, jaké bychom si představovali. V tom případě je možné enzym “vylepšit” právě pomocí řízené evoluce.

Typický enzym je bílkovina skládající se z řekněme 500 aminokyselinových zbytků s přesně danou aminokyselinovou sekvencí. Tato sekvence předurčuje vlastnosti enzymu, tudíž záměnou jediné nebo několika aminokyselinových zbytků můžeme změnit vlastnosti enzymu, například jej vyřadit z provozu, nebo naopak jej stabilizovat, či dokonce “naučit” enzym urychlovat nějakou novou reakci. Každý z aminokyselinových zbytků je možné nahradit za některou z 19 zbývajících kódovaných aminokyselin. Existuje tudíž téměř 10 000 možných variant našeho enzymu lišících se v jedné aminokyselině. Variant lišících se ve dvou zbytcích je téměř 5 milionů, variant lišících se ve třech zbytcích je více než dvě miliardy a tak dále. Je tudíž zoufalé snažit se vytvářet a testovat nové enzymy tak, že bychom systematicky měnili jednotlivé aminokyseliny.

Metoda řízené evoluce, za jejímž vývojem stojí první oceněná vědkyně, funguje tak, že je gen pro enzym (případně jiný protein) podroben mutaci. Existují například mikroorganismy s oslabenými mechanismy dohlížejícími na správnou replikaci DNA. Když je do takového mikroorganismu vložen nějaký gen, tak po čase může být izolován zpět, ale v jeho sekvenci budou obsaženy různé mutace. 

Další možností je provedení polymerasové řetězové reakce (Nobelova cena za chemii 1993), u které se většinou snažíme, aby byl přepis co nejpřesnější, ale kterou je možné uměle znepřesnit. Dalším používaným postupem je takzvaný DNA shuffling, který umožní poskládat nějaký gen z náhodných fragmentů dvou nebo více podobných genů.

Takto získáme tisíce nebo i miliony mutovaných variant našeho enzymu. Velká část z nich nebude mít lepší vlastnosti než původní enzym, ale malá část mutací se může “trefit” do toho správného místa a zlepšit vlastnost enzymu. V další fázi experimentu je nutné izolovat jednotlivé mutanty, připravit odpovídající enzymy a testovat jejich vlastnosti. Tento jinak nákladný postup je možné v dnešní době zlevnit použitím mikrofluidních zařízení. Jinou možností je využít postupy vyvinuté dalšími letošními laureáty (viz níže). Další alternativou je použít selekci. Pokud například chceme “naučit” enzym odbourávat nějakou toxickou látku, tak můžeme mutované varianty genu vložit do bakteriálních buněk. Buňky potom kultivujeme v médiu, které obsahuje toxickou látku. Buňky obsahující variantu enzymu, která umí látku odbourávat, přežijí. Z nich pak můžeme izolovat variantu genu pro náš nový enzym schopný degradace toxické látky.

Jaké je využití? Především, enzymy a jiné bílkoviny jsou málo stabilní. Jejich využití je tedy limitováno například vyššími teplotami nebo v prostředí nevodných rozpouštědel. Pokud máme gen pro nějaký zajímavý ale málo stabilní enzym, můžeme se pokusit jej stabilizovat řízenou evolucí. V roce 2012 byla Nobelova cena udělena za vyřešení trojrozměrných struktur receptorů vázaných na G-proteiny. Jedná se o transmembránové proteiny (v tomto případě nejde o enzymy), se kterými je velmi obtížné pracovat pokud jsou vytrženy z prostředí membrány. Jedním z fíglů, které přispěly k objasnění prostorové struktury těchto proteinů, byla právě jejich stabilizace pomocí řízené evoluce. V roce 2008 získal Nobelovu cenu zelený fluorescenční protein, respektive jeho objevitelé. Tento protein (opět se nejedná o enzym) má velké uplatnění v mikroskopických technikách. Kromě originálního zeleného fluorescenčního proteinu máme dnes k dispozici celou řadu různobarevných a jinak vylepšených fluorescenčních proteinů, z nichž velká část vznikla právě postupem řízené evoluce. Jak již bylo řečeno, pomocí této metody je možné “naučit” enzym katalysovat i zcela novou reakci. Například virová thymidinkinasa byla řízenou evolucí upravena tak, aby bylo možné použít její gen jako bezpečnostní prvek při genových terapiích nebo při transplantaci kostní dřeně.

Druhá polovina Nobelovy ceny byla udělena za vývoj metody zvané fágový display (nebo chcete-li fágový displej nebo fágové vystavování, nebo dokonce vystavení pomocí fágu). Fágy jsou viry, které jako hostitele využívají bakterie. Pro tuto metodu použitý fág obsahuje DNA, která nese jeho genetickou informaci, a proteinový obal. Geny, které kódují obalové proteiny, jsou součástí genomu fága. Oceněné vědce napadlo vložit do určité části genu, který kóduje obalový protein, nějaký jiný gen, který pro náš účel nazveme genem X. Tím vznikne obalový protein, který bude z části tvořen sekvencí obalového proteinu a z části proteinem kódovaným genem X. Výsledný fág tak na svém povrchu “vystavuje” protein X.

K čemu je to dobré? Zatímco první oceněný objev je inspirován evolucí, druhý objev je spíše inspirován imunitním systémem. Hlavní hráče imunitního systému, tedy protilátky, je možné připravit více způsoby. Tradiční způsob spočívá v tom, že je nějaké laboratorní zvíře naočkováno antigenem. Poté, co si proti němu vytvoří protilátky, je z něj získána krev a z ní je možné izolovat takzvané polyklonální protilátky. Modernější monoklonální protilátky (Nobelova cena za fyziologii a medicínu 1984), je možné získat znesmrtelněním slezinných buněk produkujících protilátky a separovat pouze ty buňky, které produkují určitou chemicky čistou protilátku.

Fágový display umožnil vznik další zcela nové techniky pro přípravu protilátek. Z buněk imunitního systému zvířete je možné získat gen kódující protilátky. Protože tento gen je získán z různých buněk imunitního systému, bude směsí velkého počtu variant; každá tato varianta bude tvořit odlišnou protilátku. Každá z těchto protilátek by měla být schopna vázat jiný antigen. Směs variant genu pro protilátku je pomocí metody fágového displeje vystavena na površích fágů. Každý fág tak nese ve svém genomu jinou variantu genu a protein na povrchu každého fágu přesně odpovídá genu uvnitř. Pak stačí na vhodný nosič navázat antigen a s jeho pomocí vychytat ze směsi fágů pouze ty, které mají na svém povrchu protilátku vážící náš antigen. Z nich pak můžeme izolovat DNA, zjistit její sekvenci a pomocí rekombinantní technologie produkovat neomezené množství protilátky. Metoda byla v průběhu let vylepšena zavedením dalších variant (např. ribosomální display) a zavedením pokročilých metod sekvenace DNA.

Metodu fágového displeje je možné použít spolu s metodou řízené evoluce F.  Arnoldové. DNA-polymerasa byla například “přeučena” kombinací řízené evoluce a fágového displeje na RNA-polymerasu. Stejným přístupem byla vyvinuta nová polymerasa, která umí do DNA vnášet syntetické stavební prvky.

Letošní Nobelova cena za chemii tedy byla udělena za vývoj metod, které významně přispívají k přípravě proteinů s novými vlastnostmi. Takové proteiny mohou přinést pokrok ať už v medicíně při přípravě nových léků, v průmyslu například při přípravě biopaliv z odpadních produktů nebo pro ekologičtější výrobu chemických látek pomocí enzymů upravených “na míru”.

Text: doc. Spiwok, prof .Kodíček a kolektiv autorů z Ústavu biochemie a mikrobiologie
Obrázky: nobelprize.org