Falšování potravin doprovází lidstvo již od dob směnného obchodu. V současnosti tento trend neustále narůstá. Často se jedná pouze o „nezávadné“ šizení zákazníka (náhrada dražší složky za levnější a/nebo lépe dostupnou apod.), někdy ale může falšováním potravin dojít k ohrožení zdraví spotřebitelů. Proto, ale i z důvodů náboženských, hygienických či ekonomických, je nezbytné, aby se vyvíjely také metody detekce falšování. V současné době existuje mnoho metod, které umožňují druhovou specifikaci živočichů i rostlin. Jednou z nich je analýza DNA využitím polymerasové řetězové reakce (PCR). Na Ústavu biochemie a mikrobiologie se, mimo jiné, zabýváme vývojem PCR protokolů pro autentizaci hospodářsky významných živočichů, ryb i rostlin. Co to je za metodu a jak taková analýza funguje? To se pokusím objasnit v následujícím textu.
Nejprve je potřeba získat DNA ze vzorku, který chceme analyzovat. K tomu může být využito mnoho izolačních postupů. Vždy je třeba najít nevhodnější metodu izolace, aby byla získána DNA co nejlepší kvality i kvantity. Po úspěšné izolaci je DNA naředěna na potřebnou koncentraci a podrobena analýze. Za tímto účelem je používána PCR. Co to je? Jedná se o metodu používanou pro rychlé namnožení (amplifikaci) krátkého úseku nukleové kyseliny. Proces tvorby kopií molekuly (replikace) probíhá s využitím potřebných enzymů (polymeras) in vitro, v několika se opakujících cyklech. Úsek DNA je vymezen dvěma uměle vytvořenými oligonukleotidy, tzv. primery, dlouhými obvykle 20 - 25 nukleotidů. Primery jsou komplementární vždy k jednomu řetězci templátové DNA právě v oblasti konců vybraného úseku DNA. Jejich role tím ale nekončí. Správné nasednutí primerů na denaturovanou DNA je důležité i pro samotné zahájení syntézy nového řetězce DNA. Proč? Syntézu vlákna DNA, komplementárního k původní molekule, provádí DNA-polymerasa, která neumí začít syntetizovat nové vlákno nanovo; potřebuje mít od čeho se „odrazit“. A právě to je další úlohou primerů. Polymerasa na ně dokáže napojit první bázi a poté už bez problému přiřazuje další volné nukleotidy z roztoku na základě komplementarity bazí; z jednořetězcové molekuly tak vzniká dvouřetězcová. Tento cyklus (denaturace DNA, nasednutí primerů, syntéza nového řetězce) se několikrát opakuje, až je dosaženo potřebného množství kopií DNA. Po ukončení PCR je ověřena přítomnost a velikost očekávaných produktů pomocí elektroforézy. Přítomnost a množství produktů je možné detekovat také na základě naměřené fluorescence v průběhu PCR. Je-li přítomen očekávaný produkt, byla daná DNA v analyzovaném vzorku; v opačném případě její přítomnost potvrzena nebyla.
Pro druhovou specifikaci je potřeba najít takový úsek genu, který je pro daný druh jedinečný. Pro zvířecí svalovinu lze využít například oblast genů kódujících cytochrom b (mitochondriální DNA) či interleukin-2 (jaderná DNA), pro rostliny lze hledat specifické sekvence také v chloroplastové DNA. Pro rozlišení druhů rostlin se využívají také tzv. mikrosatelity, což jsou segmenty DNA složené z krátkých opakujících se motivů nukleotidových sekvencí (obvykle do 6 nukleotidů). V současné době je na Ústavu biochemie a mikrobiologie vyvinuta metodika pro detekci koňské, hovězí, vepřové, kuřecí, krůtí a kachní DNA, a dále DNA makrely obecné. Během analýz masných výrobků z tržní sítě jsme objevili i několik falšovaných, u kterých došlo k náhradě dražšího druhu masa za levnější nebo nebylo dodržováno uváděné množství svaloviny. Je tak patrné, že i přes veškerou snahu státu kontrolovat prodávané potraviny není zatím možné prodávání falšovaných výrobků plně zabránit. Touha po ekonomickém zisku výrobců či prodejců je veliká a nám nezbývá, než se dále snažit proti takovým podvodům zbrojit vývojem nových, lepších a rychlejších metod analýz. Nyní proto na ústavu vyvíjíme také PCR protokol pro odlišení masa koz a ovcí, dalších ryb z čeledi makrelovití, ale také metodiku pro laboratorní kontrolu pravosti máku setého.
Úvodní obrázek - přeloženo podle: Rice, G. (2013): Polymerase Chain Reaction: (PCR). Microbial Life Educational Resources.
Autorka je doktorskou studentkou Ústavu biochemie a mikrobiologie
